一、涂片、干燥、固定、初染(媒染）、脫色、復染(1) 涂片：臨床標本或液體培養物可直接涂抹于潔凈的載玻片上，固體培養的細菌先在玻璃片上滴一滴生理鹽水，然后取菌少許在鹽水中磨勻，呈輕度混濁。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。
(2)干燥 涂片建議在室溫下自然干燥，或將標本面向上，置于酒精燈火焰高處慢慢烘干，切不可在火焰上燒干。
(3)固定 細菌的固定常用火焰加熱法，即將上述已干的涂片在火焰中迅速通過3——5次，溫度以手能摸時熱而不燙為度。目的在于殺死細菌，凝固細胞質，改變細菌對染料的通透性。
(4) 初染：不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆蓋菌膜為度。
(5) 媒染：通過媒染可增加染料和被染物質的親和力。媒染劑還可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。
(6) 脫色：此步驟主要目的是觀察細菌與染料間結合的穩定程度，作為鑒別染色之用。
(7) 復染：細菌初染色被脫色后常以復染液復染，便于觀察。復染液的顏色與初染液有明顯不同。
二、常用染料原液配制
一般制備100ml純酒精飽和溶液所需染料量：美蘭2g——5g；結晶紫7g——14g；堿性復紅3g——7g。
三、常用的染色方法
1、單染色法 即用一種染料染色的方法。常用呂氏美蘭或稀釋石炭酸復紅染液。
染液 ：①呂氏美蘭液，美蘭酒精飽和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成；②稀釋石炭酸復紅液 堿性復紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸餾水作10倍稀釋即成。
2、菌種：大腸埃希菌普通斜面培養物。
3、染色方法：于已做好的涂片上滴加呂氏美蘭或稀釋石炭酸復紅染液，染色1min，以水沖洗至無顏色流下為止，自然干燥或以遠火烘干后鏡檢。
4、結果：以美蘭染色者菌體呈現蘭色；以稀釋石炭酸復紅染色的菌體呈現紅色。同。
